薇甘菊对鸡粪堆肥过程中抗生素抗性基因及病原微生物的影响

2022年11月2日，华南农业大学资源环境学院、岭南现代农业科学与技术广东省实验室河源分中心王瑞龙研究员团队的博士后Yousif Abdelrahman Yousif Abdellah在生物资源技术领域国际权威期刊《Bioresource Technology》（中科院1区Top期刊，IF:11.889）发表题为《Phytochemical and underlying mechanism of Mikania micrantha Kunth on antibiotic resistance genes, and pathogenic microbes during chicken manure composting》的论文，王瑞龙研究员为通讯作者。这是该团队近来在国际环境科学与生态学领域知名期刊《Journal of Cleaner Production》（中科院2区Top期刊，IF:11.072）、《Environmental Pollution》（中科院2区Top期刊，IF:9.988）发表的第3篇关于外来入侵植物薇甘菊资源化利用的研究论文。相关研究得到了岭南现代农业科学与技术广东省实验室河源分中心（DT20220002, DT20220015）、国家自然科学基金（31971554）、广东省基础与应用基础研究基金自然科学基金（2019A1515012206）项目等的资助。该研究主要探究了薇甘菊对鸡粪堆肥过程中病原微生物和抗生素抗性基因（ARGs）的影响，证明在堆肥过程中添加薇甘菊可促进植物化学物质的合成，而合成的植物化学物质通过抑制核心病原微生物的生长来降低其毒力，同时环境中的ARGs丰度显著降低，表明薇甘菊可作为堆肥过程中的添加剂来进一步控制ARGs和病原微生物在自然界的扩散。文章中宏基因组测序和生信分析由欧易生物完成。

文章标题：Phytochemical and underlying mechanism of Mikania micrantha Kunth on antibiotic resistance genes, and pathogenic microbes during chicken manure composting

发表期刊：Bioresource Technology

(相关资料图)

影响因子：11.889

涉及的欧易生物服务产品：宏基因组测序

研究背景

鸡粪（CM）是农业生产利用的重要资源，但由于鸡粪中含有大量的病原微生物，密集的养殖条件中又使用大量抗生素，这些抗生素可通过粪便排出，导致大量病原微生物和抗生素在自然界中循环，而病原体、毒力因子基因（VFGs）和抗生素抗性基因（ARGs）的丰度是微生物污染风险评估的重要指标。薇甘菊（Mikania micrantha Kunth，MM）是一种有害的外来入侵植物，早期研究表明，薇甘菊不同部位中存在大量有抗菌作用和与抗生素有协同作用的植物化学物，目前将薇甘菊应用于堆肥过程的研究目前还很少，对于薇甘菊相关植物化学物是否可以降低ARGs、VFGs和病原微生物的研究也缺乏了解。

本研究旨在通过宏基因组分析，探究薇甘菊对鸡粪堆肥过程中病原微生物和ARGs丰度的影响，以期更全面了解薇甘菊这种入侵物种作为添加剂在堆肥过程中的作用，从而间接改善生态环境。

研究结果

1. 薇甘菊在堆肥过程中对KEGG通路中分子功能的影响

进行宏基因组测序后，通过分析KEGG通路和碳水化合物酶检出的相关基因丰度来探索在堆肥过程中薇甘菊所响应的分子功能变化，结果显示，在添加薇甘菊进行堆肥后的第1天、第3天和第32天，KEGG L1水平富集的通路主要集中在代谢途径上，并且在第32天代谢通路基因水平达到最高（图1A）。在KEGG L2水平上，碳水化合物代谢相关基因水平随着堆肥过程逐渐降低，T1样本变化最为显著（图1B），说明添加剂在堆肥过程中促进了微生物活性，碳水化合物不断消耗，代谢水平不断升高。在KEGG L3水平上，与先前报道一致，不同抗生素在CK组样本丰度更高，而萜类化合物则在T组样本中丰度更高（图1C），这些相关途径主要通过形成植物化学物质作为抗菌素，从而阻断病原体的生长和分布。此外，在堆肥过程中添加薇甘菊也能增强与植物化学形成相关的其他途径，如萜类主链生物合成、泛醌和其它萜类醌生物合成，这些植物化学物丰度的增加则可能会协同抑制或减少堆肥产物中存在的广谱ARGs（图3b）。

图1 | 鸡粪堆肥过程中主要KEGG代谢通路和相关途径的相对丰度

2. 薇甘菊对整个堆肥过程中抗生素变化的影响

进一步通过宏基因组测序评估抗生素以及ARGs如何响应薇甘菊在堆肥过程中所产生的影响，在CK1、CK3、CK32、T1、T3和T32中分别检测到32、32、32、30、29和28种抗生素，在不同堆肥时期T组均有不同种类抗生素显著低于CK组（p<0.05)（图2），表明薇甘菊相关的植物化学物质对堆肥后期抗生素的消除有显著积极作用，同时在堆肥结束阶段，T32中的抗生素丰度显著降低，可能是由于堆肥过程中温度升高加速抗生素的降解。

图2 | 堆肥样品中抗生素类型的相对丰度

3. 堆肥过程中薇甘菊对抗生素耐药机制和ARGs响应的进化机制

继续对堆肥过程中微生物群落的抗生素耐药机制进行分析，结果表明抗生素外排、抗生素失活和抗生素靶点保护是堆肥过程中主要的抗生素耐药机制，表现为T组这三个功能的丰度显著低于CK组（图3a），说明添加薇甘菊可以限制堆肥产品中抗生素耐药性机制的变化，从而减少其对环境的威胁。

堆肥后ARGs丰度的变化如图3b所示，除MGEs外，抗大环内酯、抗磺胺和抗四环素的抗性基因在堆肥过程中始终保持相对高丰度，以往研究表明，堆肥很难降低磺酰胺抗性基因的丰度，但与CK组相比，T组样本中抗大环内酯、抗磺胺相关基因和抗四环素相关基因的丰度均有下降趋势，并且随着堆肥的进行下降趋势更为显著，表明堆肥过程中添加薇甘菊可有效减少和去除这些抗生素抗性基因，而由于堆肥温度的升高和与薇甘菊相关的植物化学物质具有广谱杀菌功能共同导致了ARGs及宿主微生物的减少。

图3 | 堆肥样品中抗生素耐药性机制相关基因的相对丰度变化

4. 薇甘菊对堆肥过程中致病菌丰度的影响

研究表明堆肥中PHIs的增加也会促进病原体的致病性和ARGs丰度，本研究同样考虑了PHIs的分布和丰度，在CK1、CK3、CK32、T1、T3和T32样本中，鉴定出的作为最高优势PHI的病原菌总数分别为47、47、46、45、44和33种（图4），与T堆肥相比，CK堆肥具有更高的病原体数量，随着堆肥的进行，在T3样本中的丰度也进一步低于T1和CK3样本（P < 0.05），甚至在T32中，某些病原体未被检测到，这可能是植物化学物质增加所致，同时相对较高的堆肥温度可能会通过改变堆肥的物理化学特征，使各种病原体失活，并浓缩抗生素的生物利用度，而由于堆肥过程中薇甘菊相关植物化学物质丰度和功能的差异，致使病原体的多样性也存在显著差异。

图4 | 不同阶段堆肥样品中优势PHIs的总相对丰度

5. 薇甘菊通过堆肥对微生物毒性变化的影响

进一步探究堆肥过程中添加薇甘菊对病原体及其毒力因子的影响，结果显示在堆肥过程中，优势VFGs的丰度存在显著差异，CK组VFGs的丰度最大，各个时期T组与分枝杆菌、假单胞菌和链球菌相关的VFGs的丰度均显著下降（见原文表2），表明薇甘菊可显著减低堆肥产品中的病原体及其毒力因子。

6.堆肥过程中与薇甘菊相关的植物化学物质、ARGs和PHIs之间的关系

通过分析不同堆肥时间PHIs、ARGs和植物化学物KEGG丰度之间的关系发现，在整个堆肥过程中，T组的PHIs和ARGs丰度始终低于CK组，而T组与植物化学物质相关的KEGG丰度显著高于CK组（图5），PHIs丰度的降低可能是在鸡粪堆肥中去除和减少某些ARGs导致，而增加的类黄酮等植物化学物质则有可能是作为抗菌剂来影响病原微生物的生长、功能或活力，或者通过靶向微生物的毒力因子来抑制抗生素耐药性，表明与薇甘菊相关的植物化学物质通过堆肥改变了PHIs和ARGs的丰度和分布，解释了薇甘菊抑制病原体生长的潜力，同时也改善了堆肥的质量和安全性。

图5 | 堆肥过程中与植物化学物质相关的KEGG功能、ARGs和病原菌相对丰度之间的关系

7.堆肥过程中理化因素、ARGs和PHIs之间的关系

据报道，理化因素、微生物群落及其相互作用可能会显著影响ARGs的分布和丰度，因此，作者继续探究影响堆肥过程ARGs水平的其它理化因素，发现在堆肥过程中物理化学因素对ARGs和PHIs的影响显著不同（图6a），CK组堆肥温度(T)、pH、含水量（MC）和TOC之间呈显著的正相关关系（P < 0.05）；同时，pH与MC、TOC、部分ARGs和PHIs：1385（小麦镰刀菌）呈显著正相关（P < 0.05），而TOC与T、pH、MC和部分ARGs呈显著正相关，这些结果表明，提高TOC比例可以通过增加宿主微生物的活性从而增加ARGs的丰度 （P < 0.05）。

温度是堆肥过程中微生物群落分布变化的关键决定因素，T组的相关性结果显示（图6b），堆肥温度(T)与病原微生物及部分ARGs呈显著负相关，表明堆肥过程中的高温可以有效地破坏堆肥产物中的病原微生物和ARGs，并且由于耐热病原菌持续存在，导致温度与部分病原菌和ARGs呈显著正相关。同样，pH、MC和TOC与不同ARGs和病原微生物也存在显著正相关或显著负相关情况，说明在堆肥过程中添加薇甘菊可通过改变微生物生长环境来影响ARGs的丰度及分布。这些结果进一步表明，薇甘菊可有效地重塑理化因素对PHIs和ARGs下降的影响，从而降低病原微生物及抗生素抗性基因等有害物的传播与扩散，提高了堆肥产品的安全性。

图6 | 基于理化因素、ARGs和PHIs之间的皮尔森积差相关性的多变量分析（MVA）

研究总结

本研究通过在鸡粪堆肥过程中添加薇甘菊（MM）再进行宏基因组测序，通过分析植物化学物质相关的KEGG功能、ARGs和PHIs的丰度变化及相互之间的相关性，表明堆肥中ARGs丰度下降与薇甘菊含有的植物化学物质丰度的变化和堆肥过程中的理化因素有关，添加薇甘菊可促进堆肥过程中二苯乙烯类、二芳基庚烷类和泛酚类化合物的合成，这些合成的植物化学物质可通过抑制核心病原微生物的生长来降低其毒力，从而显著降低ARGs的丰度。这些发现为证明薇甘菊作为添加剂可有效控制堆肥产品中ARGs和PHIs的扩散提供了有力证据。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.128241

DOI:10.1016/j.biortech.2022.128241